质粒数据库

A. 在哪里可以找到各种载体的序列啊

ncbi有数据库 ，zmbl也可以。

载体（Vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

在实际生活中，胰岛素就可以通过使用载体将已插入胰岛素基因片段的质粒放入大肠杆菌内。经过插入基因片段的质粒就称作载体。该质粒在细菌内可以进行自我复制，并且不会影响到生物原来的活动。

质粒载体

质粒载体是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。

噬菌体载体

利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。

B. 如何设计质粒

网络文库搜索质粒构建和引物设计即可，很详细。
引物设计的原则
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （proct length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（plex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增 加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest
neighbor method) [6][7]。
6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC
2
含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数 商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在 这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“ector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件 的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo” 进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、
限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源
性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中
最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、
语音提示键盘输入（ ）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见 结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会 遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结 构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒 体（Inertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（ertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功 能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列 等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）
等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按， 这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物 (Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分 为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”
主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些
5 性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引 发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最 好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易
使用，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最着名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo .22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6
至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发6的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili 项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左 下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结
合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线 为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值 越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构， 而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基 因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较 高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的7
8
模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的 引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。

C. 怎么找到一个质粒的基因图谱啊质粒是pcDNA3.1,谢谢啦！怎么能从NCBI上查到呢/

这是我刚做的作业：在NCBI网站上找到大肠杆菌、酿酒酵母、斑马鱼的基因组图谱，并将操作步骤和查找的结果截图。
首先，打开NCBI主页进入genome数据库。

然后在网络上 搜索物种的拉丁名 输入到 for
1， 大肠杆菌：Escherichia coli

任意选择一个基因 比如打开 NC009436 结果如下

D. 质粒抽提后，进行测序，想看一下多克隆位点序列。在与GenBank数据库比对时，发现差异好大，请问如何比对

请问你是用质粒上多克隆位点附近的引物进行的测序吗？由于测序结果头部序列会受到荧光染料干扰会有几十BP序列不是很准确，你需要双向测序后进行拼接，连成一条链后再在数据库比对，或者是网上下载DNASTAR之类的比对软件来分析比对。

E. 如何用电脑软件绘制质粒图谱

一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位点：MCS 克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA 作用 。

二、如何阅读质粒图谱

第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori 的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记：

（1）Ampr：水解β -内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

（5）hygr：使潮霉素β 失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源DNA 片段。

F. 现有一质粒，如何用Vector NTI分析该质粒的抗性

假设现在只知道序列而不知道质粒名
使用Alberta大学的在线程序PlasMapper，输入序列之后确保Feature Options里面Selectable Marker选中（其它选项不需要都可以去掉）。点击Graphic Map生成质粒图谱，如果出现标记kan2 marker就是卡那抗性。

另一种方法是去NCBI做BLAST使用nucleotide blast选择nucleotide collection数据库，找到最相近的载体名，然后去/google相应的载体图

G. miRNA构建在质粒上是用miRNA的什么序列，cDNA还是在染色体上的基因序列，在什么地方查

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，目前发现的数量就那么几条，从基因组DNA上转录下来，经过两次剪接，成为成熟的MiRNA。
给你三个数据库和软件：
miRbase：microRNA基因注释数据库。目前miRBase只提供了microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。

Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。
PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率也较低。

H. 大家知道，NCBI质粒数据库中这每一个压缩文件表示什么，他们是不同的质粒数据库么求解答

DriverManager // static { try { java.sql.DriverManager.registerDriver(new Driver()); } catch (SQLException E) { throw new RuntimeException("Can't register driver!"); } } 原来，Driver在static块中会注册自己到java.sql.DriverManager。

I. 为什么质粒天然存在

什么是质粒，质粒（plasmid）存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。网络，对于和DNA、蛋白、微生物打交道的同学来说，质粒是相当常见的东西，如定义所说，质粒是一种小型环状DNA分子。质粒常用于搭载外源基因，导入受体菌种，进行蛋白表达。老簏见过或者听说过的质粒没有100 也有80，而实际用过的只有10来种。在目前Addgene质粒数据库中，已经收藏了大约45000种质粒，有的质粒是天然的，有的是人为设计的；有的适用于微生物，有的则是用于更高级细胞；有“无限”复制的pUC系列，也有兄弟众多的pET系列。总之质粒种类繁多，变化多样，在接下来的内容中，我们就来聊聊，一般的用于微生物表达的质粒有哪些特点。任质粒如何变化，老簏认为，有四个方面信息是我们在选择质粒之前应该考虑的：复制源（origin of replication）、复制能力（ number）、抗性选择（antibiotic resistance）和与其他质粒的兼容（incompatibility）。复制源--origin，pBR322，这是最早适用于大肠杆菌E.coli分子克隆的质粒，至今仍然有很多人在用pBR322及其衍生版本。pBR322（GeneBank accession: J01749.1）是由两名墨西哥科学家Boliver (B) 和Rodriguez (R) 于1977年设计的，长度在4.5kb左右，包含一个复制源序列（rep）、一个rop蛋白序列、一个Ampicilin抗性片段（AmpR）和一个tetracycline抗性片段（TetcR）。rep复制起点序列是质粒上十分重要的一个组成部分，它诱导宿主细胞启动DNA复制机制，使得质粒本身得以复制。pBR322的复制起点序列被称为pMB1，而这里的pMB1并不是一个能诱导极高复制能力的起点，但也可以保证每个宿主细胞包含15-20个质粒。

J. 基因组数据库的线虫数据库

AceDB是线虫(Caenorhabditis elegans)基因组数据库。需要说明的是，AceDB既是一个数据库，又是一个数据库管理系统。AceDB基于面向对象的程序设计技术，是一个相当灵活和通用的数据库系统，可用于其它基因组计划的数据分析。AceDB最初是基于Unix操作系统的X窗口系统，适用于本地计算机系统。AceDB提供很好的图形界面，用户能够从大到整个基因组小到序列的各个层次观察和分析基因组数据。新开发的WebAce和AceBrowser则是基于网络浏览器。Sanger中心已经将其用于线虫和人类基因组数据库的浏览和搜索。库内的资源包括限制性图谱，基因结构信息，质粒图谱，序列数据，参考文献等等。