php层析

A. 疏水层析的相关知识

在
丁香园
生物网络
（
http://dxy.ac.cn
）
总结
：
离子交换
层析：
http://dxy.ac.cn/wiki/viewthread.php?tid=458&
highlight
=%C0%EB%D7%D3%BD%BB%BB%BB
离子交换层析
离子交换层析是利用
离子交换剂
上的
可交换离子
与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱
层析法
。该法可以同时分析多种
离子化合物
，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最常用的层析法之一，常用于多种离子型
生物分子
的分离，包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。
离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃交换剂的
玻璃管
中进行的。离子交换剂为人工合成的多
聚物
，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为
阴离子交换剂
和
阳离子交换剂
。含有预被分离的离子的溶液通过
离子交换柱
时，各种离子即与离子交换剂上的
荷电
部位竞争结合。任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。
离子交换剂是由基质、荷电基团和
反离子
构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。
离子交换层剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的
离子交换反应
是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中
解离
出来的阳离子A＋与溶液中的阳离子B＋可发生可逆的交换反应：RA+B+↔RB+A+；该反应能以极快的速度达到平衡，平衡的移动遵循
质量作用定律
。
溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换，一般来说，。。。。
疏水作用
层析，建议看看这个，或者搜索
http://dxy.ac.cn/wiki/viewthread.php?tid=461&highlight=%CA%E8%CB%AE
参考资料：http://dxy.ac.cn/wiki/viewthread.php?tid=183&highlight=%C0%EB%D7%D3%BD%BB%BB%BB

B. 物理学的发展史

近代意义的物理学诞生于欧洲15—17世纪。人们一般将欧洲历史作为物理学史的社会背景。从远古到公元5世纪属古代史时期；5—13世纪为中世纪时期；14—16世纪为文艺复兴运动时期；16—17世纪为科学革命时期，以N.哥白尼、伽利略、牛顿为代表的近代科学在此时期产生。

从此之后，科学随各个世纪的更替而发展。近半个世纪，人们按照物理学史特点，将其发展大致分期如下：从远古到中世纪属古代时期。从文艺复兴到19世纪，是经典物理学时期。牛顿力学在此时期发展到顶峰，其时空观、物质观和因果关系影响了光、声、热、电磁的各学科。

甚而影响到物理学以外的自然科学和社会科学。随着20世纪的到来，量子论和相对论相继出现；新的时空观、概率论和不确定度关系等在宇观和微观领域取代牛顿力学的相关概念，人们称此时期为近代物理学时期。

(2)php层析扩展阅读：

伽利略·伽利雷（1564~1642年）人类现代物理学的创始人，奠定了人类现代物理科学的发展基础。1900~1926年 建立了量子力学。1926年 建立了费米狄拉克统计。1927年 建立了布洛赫波的理论。1928年 索末菲提出能带的猜想。1929年 派尔斯提出禁带、空穴的概念。

同年贝特提出了费米面的概念。1947年贝尔实验室的巴丁、布拉顿和肖克莱发明了晶体管，标志着信息时代的开始。1957年 皮帕得测量了第一个费米面超晶格材料纳米材料光子。1958年杰克.基尔比发明了集成电路。20世纪70年代出现了大规模集成电路。

发展前景：

应用物理学专业的毕业生主要在物理学或相关的科学技术领域中从事科研、教学、技术开发和相关的管理工作。科研工作包括物理前沿问题的研究和应用，技术开 发工作包括新特性物理应用材料如半导体等，应用仪器的研制如医学仪器、生物仪器、科研仪器等。

应用物理专业的就业范围涵盖了整个物理和工程领域，融物理理 论和实践于一体，并与多门学科相互渗透。应用物理学专业的学生如具有扎实的物理理论的功底和应用方面的经验，能够在很多工程技术领域成为专家。我国每年培养本科应用物理专业人才约12000人。

和该专业存在交叉的专业包括物理专业，工程物理专业，半导体和材料专业等。人才需求方面，我国对应用物理专业的人才需求仍旧是供不应求。

C. 急需以下物质的分析方法。气相或者液相。

我是学分析化学的
你说的这些东西最好的分析方法是用液相色谱法
具体的分析很复杂,其原理相当于高中生物书上叶绿素的分离.

下面是详细的说明
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[讨论：DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相

式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。

当达平衡时：

KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

根据定义，分配系数为：

DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[讨论：DX与保留值的关系]

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)

用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：

抑制柱上发生的反应：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

D. 氨基酸纤维素薄层层析的展开剂中冰醋酸有什么作用

没有重大差别。用纸做层析，效果重复性相对差一点，对分离物的吸附性更强一些，需要用极性比较大一些的剂进行操作。这是与用硅胶进行TLC分离相对比而言的。

E. 请问什么是活性的超氧化物歧化酶，人工是如何制造出来的

超氧化物歧化酶(SOD) 超滤法生产新工艺

前 言

SOD的中文名称是超氧化物歧化酶，其英文名为Superoxide dimutase，分子量(牛血红细胞) 约 32000 是广泛存在生物体内的金属蛋白醇 ， 别名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科学家誉为21世纪最有发展前途的药用酶。

一、本工艺是从红细胞，肝和其它哺乳动物组织分离而得的金属酶；含两个亚基，每个亚基各含一个铜原子和一个锌原子，SOD可催化O2，歧化为H2O和O2， 其性质不仅仅取决于酶蛋白，而且还取决于活性部位的金属离子，按金属离子类型不同， 可分为Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三种.在一般条件下，SOD较稳定. 不同来源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光谱略有差异，如牛血SOD在258nm处显示最大吸收，而猪血SOD的最大吸收峰为265nm，在特定条件下，酶的活性可下降，甚至完全丧失， 如氰化物可抑制SOD活性，双氧水使SOD活性下降，氯化胍能明显抑制SOD活性等。

二、SOD用途主要是基于SOD是超氧阴离子清除剂，超氧阴离子(O2~)是人体内有毒物质，它能引起多种疾病，故能清除炎症过程中伴同产生的超氧离子， 而显示出强大的抗炎作用。

在医药工业：SOD可以治疗由于超氧离子引起的各种疾病，如糖尿病，白内障， 风湿性关节炎等，也是消炎的有效药物，而且还能抗衰老，抗肿瘤，抗辐射， 抗自身免疫疾病，现代研究表明：SOD还能治高血压，冠心病，胆囊炎，肺气肿等难治之症. 日用化学工业：由于SOD有防止细胞老化和解毒等功效， 因此在化妆品和护肤剂等工业产品中，添加SOD之后，具有防晒，祛斑，使皮肤柔嫩的作用.是目前化妆品行业中不可缺少的一种添加剂，国内及同行都已出现大量产品.食品工业：在食品添加剂加 SOD之后，增强营养，解除毒性，延长体内细胞寿命，国内已有SOD营养液产品， 并通过上海科研单位有关专家的鉴定。

三、SOD的开发前景：目前SOD在全国仅有少数科研单位及生化制药厂研究和开发本产品，而使用SOD产品厂家却日益增多，远不能满足市场需求 . 为鼓励和大力开发SOD新产品，国家已将其列入重点科技开发项目，并投放大批经费，现已获得成功， 开始向企业化生产转移，市场前景十分广阔。

四、注意事项：(1)我中心热忱欢迎社会各界朋友现场学习，由生化工程师向您授课，通过现场操作，指导，培训，使您尽快掌握该技术。(2)本工艺， 技术资料等不经我公司同意，不得擅自转让，翻印，销售给任何单位和个人，违者法律追究。

新法提炼技术

一、主要设备：(1)工业用离心机一台；(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台；(3)冰柜1台；(4)搅拌机1台；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml烧杯各3只，50ml烧杯 2 只，50ml，500ml量杯各1个；(6)塑料桶若干个。

二、主要试剂：(工业纯度)柠檬酸钠，柠檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，去离子水或蒸馏水，葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.

三、试剂的配制：

1.抗凝剂配方：(1)柠檬酸钠30g，柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，一般此种是每7ml血液，加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液：在1升水中加入0.9克的氯化钠。

2.生理盐水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠。

3.磷酸盐缓冲溶液的配制：PH7.6，0.2M磷酸盐缓冲溶液，一般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液，如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升，NaH2PO4.2H2O为31.21克/升，仍是前者87.0ml，后者13.0ml混合后即得。

4.冷却剂：在本工艺中有使用-15度低温，一般用如下配方：用33克食盐加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合体可达-21.3度。

四、工艺流程

(一)除血红蛋白

1.血液抗凝处理，在新鲜牛、马、猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂，并缓慢搅匀，每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂。

2.把抗凝处理的血液放入离心机，以3000r/min离心约15--20分钟， 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉，下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次，在每一次洗涤中，用离心机以3000r/min离心，7--8分钟，反复操作后，得到洗涤血红细胞，洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活，在血液量大， 处理不完时必须这样做。

3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30分钟，使红血球细胞壁砍碎，以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后，把溶血进行有机提取。

4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿，搅拌10--15分钟后，原溶血呈浆糊状，静止1--2小时，用滤布除去凝固的血红蛋白，然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀， 此时如果上清液略为微黄色时，可用快速过滤纸过滤，可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液。

(二)粗酶液的初步提纯：

1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沉淀 ， 以3000r/min离心2分钟收集沉淀，上清液可不必吸取，直接倾倒。

2.热变性：(除杂蛋白)准备好衡温浴锅，在本工艺中，提前30分钟， 注满水接通电源后，使之加热到55--60度以省时间，将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液，水浴加热至60度，15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液，在上清液中，缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮，生成白色沉淀。

3.初纯SOD：在上述沉淀中加去离子水，制成20--30%SOD溶液，分装入样品瓶中，放入冷冻干燥机中，于开机后以0.2--0.1Torr真空度，约1.5--2小时， 得到化妆或食品用SOD，该产品比活大于3000u/mg，外观呈微带蓝色的白色冻干品。

(三)SOD进一步提纯：

SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析，柱层析后的SOD没有小分子等杂质， 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高，它主要作为生物化学试剂， 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种，二者可单独使用，也可结合使用，一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析，将(二)2，热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解，有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀，上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脱 ， 洗脱液为PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4缓冲液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液，合并活力峰，再用蒸馏水反复透析，透析彻底后， 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品。

五、注意事项：

1.掌握适当的温度和时间：虽然SOD对热较稳定， 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度，一般以0--10度为宜，时间长不要超过3天。

2.注意提取，提纯方法：使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质， 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果。

六、SOD的检测方法：活性检验，比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法， 先测得连笨三酚的自氧化速率，然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率，按照酶活性单位定义，即在最佳条件下，每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ，同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度，看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.

超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。

自1969年Mccord和Fridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，1988年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。

SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过20种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。

我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。

本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为CuZu-SOD。

一、药品与仪器：

(1)柠檬酸三钠：Na3C6H6O7 (2)工业丙酮CaH6O

(3)邻苯本酚 (4)酸磷钾K3Poe4

(5)弱碱性阴离子交换剂DEAE Sephadsxa-50外观40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纤维素。 (6)冷冻干燥器(自己组配)

(7)层折柱(7.5＊30cm) (8)离心机

以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购买。

二、Cu、Zu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)

1、工业流程：

加抗凝剂 盐洗

鲜牛血--------------------->红血球------------------------>

离心除黄色血浆 加NaCL

热变性1 热变性2

压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->

68度30分钟 60-65度20分钟

加丙酮 加丙酮 层析

浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>

冻干

透析除盐

洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)

2、提取方法

(1)收集红细胞：鲜牛血100升，加入3. 8％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入3倍量0.9％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(40升)。

(2)热变性1：收集的红细胞再加入4公斤氯化钠，40克氯化铜，蒸馏水100升搅匀，水浴加热到68度恒温30分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。

(3)热变性2：滤液在65度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入40克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温20分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。

(4)SOD粗品：超滤心清液加入0.75倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品

(5)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于2.5mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液，将该混合液上在7.5＊30cm的层柱上，离子换剂为DEAE-SphadexA-50(该柱事先用缓冲平衡)，以100～200ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲A280mm值，低于0.02然后用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为100ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。

三、SOD活性测定：

SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。

1、试剂及仪器

(1)邻苯本酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度计。

2、测定方法：

(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：

测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

0.0700－A325mm/min

----------------------------------------＊100％度

0.70

样液稀释倍数 样液稀释倍数

酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------

50％ 样液体积

3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：

SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的计算：

单位活力(u/ml) 总活力

比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白

蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白

四、Cu、Zn－SOD性质：

1、Cu、Z n－SOD呈蓝绿色，分子量在3200左右，由两个中一个Cu和一个Zn。

2、对热稳定，天然牛血SOD，75度下加热数分钟其酶活丧失很小。

3、PH值对SOD的影响，SOD在PH5.3～10.5范围内，其催化速度不受影响，PH3.6时SODZn脱落95％，PH12SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。

4、SOD的紫外线吸收特征：SOD在280mm处没有吸收高峰。

5、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Zn仅于分子结构有关，而Cu与催化活性有关。

6、SOD是其具有还有和失活作用的。

五、药品与仪器：

柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；

工业丙酮：上海溶剂厂；

邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；

六、SOD的包销单位：

(1)河南郑州国营圣科研究所郑州南阳路14号 邮编：450053《河南科技报》91年10月3日

(2)四川省金堂县工艺制品技校生化科接待室：金堂准口执行的院内，政府办公大楼1楼 邮编：610404 联系人：邓勇 彭丽 《四川农村报》 91年3月1日

(3)广东省深圳市上步区石夏东二苍14号科技所 邮编：518031联系人：黄秋林 《科技消息报》92年7月10日

说明：1、资料后附的产品销售地址信息均为我们从近两年的报刊上摘录的各单位广告，并注明有出处。

2、你先看完资料后，行根据自己的实际情况，先小量试验， 并事先联系好产品的收购单位，待取得经验后再批量生产。

3、读者在联系收购单位时，请一定事先去联系，并附上邮资， 待得到明确答复后再根据情况去人办理，千万不要冒然前往，以免造成不必要的经济负担。

4、原料及仪器各地经营原料店供应，广州市人民南路，上九路等地均有供应。

附：详细SOD收购信息

1、广西南宁市生物化学制药厂

地址：鲁班路1号

2、上海生物化学制药厂

地址：海主路513号

3、江苏徐州市生物化学药厂

地址：海沛路86号

4、山东兖州市生物化学制药厂

地址：肉联厂内

5、湖南常德生物化学制药厂

地址：肉联厂内

6、佛山市生物化学制药厂

地址：佛山市

7、广州市明兴制药厂

地址：广州市河南路工业大道北48号

8、广州市白云制药厂

地址：从广州越绣公园坐21路车到三元里北展下车沿着矿泉别墅侧入200米

9、哈尔滨生化药厂哈肉联厂

地址：哈尔滨道外南极街12号院；电话：88423转制药厂

10、沈阳市生物化学制药厂

地址：哈尔滨皇姑区明廉路2号；

11、江苏省南京生物制药厂

地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近；

12、浙江省金华生物化学制药厂

地址：浙江省金华市河盘桥路51号

13、广东生物制药厂

地址：广州市三元里

14、广东汕头市生物化学制药厂

地址：湖山路西巷3号2号；电话：666124

11、江苏省南京生物制药厂

地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近

12、浙江省金华生物化学制药厂

地址：浙江省金华市河盘桥路51号

13、广东生物制药厂

地址：广州市三元里

14、广东汕头市生物化学制药厂

地址：湖山路西巷3号15.上海霞飞日用化工厂

16.北京丽源日用化工厂

17.南京化妆品厂

18.上海日用化学品二厂

19广州美容化妆品厂

20南京第二药物化学制药厂

上海永芳日用化学品厂

广州化妆品厂

杭州市凤喜化妆品厂

上海日用化学品四厂

天津市津乐制药厂

杭州第一生物化学制药厂

上海药物研究所实验药厂

天津市南开区美容化妆品厂

苏州市昊县生物化学厂

上海生物化学制药厂

天津生物医学技术开发中心

上海香海美容品厂

北京日用化学品四厂

武汉市辛安渡制药总厂

湖北沙市生化制药厂

北京市三露厂

注各大制药厂化妆品厂美容院均为销售对象

电话：010-68150495，68212139

传真：010-68212015

地址：北京市石景山区吴家村华电集团大楼三层

通讯：北京市石景山区40-021信箱

邮编：100040

F. 蛋白质的分离纯化技术有哪些

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的 SO4 和 NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4 度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25 度）比 0 度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25 度时饱和溶液为 4.1M，即 767 克/升；0 度时饱和溶解度为 3.9M，即 676 克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常
用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同 pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一 pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的 pH 位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质
从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

如果你有蛋白质纯化方面的技术服务需求，可以来百替生物看看，网址是：http://www.100biotech.com/index.php