sirna产品如何配置

A. 如何选择siRNA转染试剂

多查多问多试验

市面上的转染试剂品种很多，商家们还在不断推出新产品，如此多的选择难免令人感到无所适从，怎样才能找到最适合自己的产品呢？转染试剂的选择主要取决于细胞类型、细胞种属和下游实验。

细胞系不同，它们所需的转染条件自然也不相同。举例来说，悬浮培养的鼠类原代细胞，就比贴壁培养的人类细胞更难转染。此外，神经元和巨噬细胞也令人颇为头疼，标准方法很难将siRNA转染进去。

不论是哪种情况，经验数据都具有无可取代的价值。查阅文献，与其他研究者多交流都能获得宝贵的信息。当然，我们也可以在供应商提供的资料中，查看已成功转染的细胞类型。尽管这些资料中可能并没有siRNA转染的专门信息，但了解转染试剂已经成功转染了哪些细胞，是很有帮助的。

此外，我们可以向商家索要一点样品，或者向同事借用一些，对自己的细胞进行试验。幸运的话，在几天内就可以锁定合意的产品。在这里花少许时间，总好过因为实验结果不理想而要重头再来吧。

B. 体积、药剂量、浓度比例关系换算

一、药物浓度的表示方法
药物浓度是指一定量液体或固定制剂中所含主药的分量。表示混合物组成标度的量可分为4类：1．“分数”；2．“质量浓度”；3．“比例浓度”；4．“浓度”。在医疗工作和动物实验中最常用的是“分数”和“质量浓度”，有时也用“比例浓度”和“浓度”。
1．“分数”
由于药物或溶液的量可以用体积或重量表示，因此有不同的表示方法。
(1)质量分数：即每100g制剂中含药物克数，适用于固体药物，如10%氧化锌软膏100g中含氧化锌10g。
(2)体积分数：即100ml溶液中含药物的毫升数。适用于液体药物，如消毒用75%乙醇，即100ml中含无水乙醇75ml，相当于质量分数75%乙醇。
2．质量浓度
即每升溶液中含药物的克数或毫克数，单位g/L或mg/L。如原来的5%葡萄糖即每100ml含葡萄糖5g。此法最常用。

C. siRNA实验方法和设计常见问题解答

Q:如何选择转染方法和转染试剂？

A:我们的siRNA适用于各种转染方法。转染方法和转染试剂的选择，需要根据细胞来选择，对于容易转染的细胞，常用的转染方法是脂质体转染。

Q:对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？

A:1)对于贴壁细胞，推荐采用转染试剂转染即可；2)对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。

转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。具体可以参考我们的产品说明书。

Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关？

A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法，而于siRNA的序列并没有直接关系。因此，siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。

Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜？

A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用lipofectamine 2000作为转染试剂，单独转染siRNA，30%～50%密度较佳；而siRNA与质粒共转染，密度可以到80%-90%。

Q:siRNA转染时的培养基要求，可否含血清？

A:不同的转染试剂可能有不同的要求，对于lipofectamine 2000，在配制siRNA和lipofectamine 2000混合物时不能含有血清，但细胞培养基可以含有血清，但不能含有抗生素。

Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别？

A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度，锐博推荐的贮存液浓度为20 μM；而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度，一般10～100 nM范围内，锐博生物推荐的转染浓度是50nM。

Q:转染时该如何分组？分组的目的是什么？

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Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要？

A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说，当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。

Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用？如何选择？

A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA，用于监测实验体系和实验方法的可行性。我们可以提供的阳性对照siRNA有针对GAPDH，ACTB，GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照，客户可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA，主要用于说明siRNA作用的特异性。阴性对照的选择可以是通用的序列（universal）或是随机打乱的序列（scramble），客户可以根据实验要求选择。

Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率？是不是每次实验都必须做？

A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记，可以通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪等荧光检测仪器检测。 除此之外，还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关，同等实验条件下，每次转染细胞转染效率应该是相近的，因此可以不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组，将会更加便于排除一些实验问题。

Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段？

A:FAM在495nm处有最大吸收率，在520nm处有最大发射率。

Cy3在550nm处有最大吸收率，在565nm处有最大发射率。

Cy5在643nm处有最大吸收率，在667nm处有最大发射率。

Q:转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？

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Q:到了转染时间发现细胞密度太低，该如时转染还是让细胞多长一天再转染？

A:细胞生长需要一定的密度，而转染试剂对细胞有一定的毒性，如果转染时细胞密度过低，细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性，一般也不建议用生长几天的细胞做转染。

Q:siRNA的作用效果应该如何检测？

A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果

3）根据目的基因的功能，从细胞表型的水平检测。

Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间？什么时候才是最好的检测时间？

A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象，不能稳定传代，一般其作用时间不可能维持很长时间，通常建议在转染后3 4天内完成检测。最佳检测时间，因细胞、目的基因而异，多在转染后24 48小时之间检测。

Q:为什么要强调mRNA水平检测？可以直接检测蛋白和功能吗？

A:siRNA直接作用于mRNA，因此mRNA水平检测是最直接在指标。

很多客户认为，mRNA的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降，因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上，很多情况下往往出现，mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有：

Q:干扰效率多高才是好的靶点？

A:没有明确的界定，干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同，不同基因的表达水平也相差较大，主要看干扰效果而定。

Q:沉默效果不理想，应该如何处理？

A:最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求，可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。

Q:siRNA反而使得目的基因表达上调了，这是什么原因？该怎么解决？

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Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果，这说明了什么？

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Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样？如果偏差很大该怎么办？

A:正常情况下，各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大，只需考虑实验结果的准确性。另外，对于一些特定的基因，比如与细胞难受压力相关的基因，又如参与细胞免疫的基因，可能会对外界压力比较敏感，使得各组对照的基因表达发生变化不一致。

Q:用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？

A:当干扰效率不佳时，可以在一定范围内适当优化转染浓度，通常优化的范围是10~150nM，但不宜过大，高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。

Q:同样的siRNA，为什么在细胞A很有效，在细胞B则没有效果？

A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样，这些都与siRNA的作用效率有关
siRNA实验方法和设计常见问题解答- 答疑集锦- 非编码RNA研究策略-锐博技术专题专题—丁香园会议频道 (dxy.cn)

D. siRNA转染答疑专题总结（下）

Q9: 刚开始做实验，准备把RNAi的片段转入染色体内稳定表达，不知道是shRNA还是siRNA哪个比较好而且效率比较高？另外，一个载体里同时放两个针对不同基因的shRNA会不会相互影响？

A9: 稳定转染当然是shRNA。关于一个载体2个shRNA，涉及到2个shRNA的表达和加工的问题，关键还是2个shRNA都需要顺利表达的问题，这就和你的载体，以及2个shRNA在载体的排列有关系。至于蛋白之间的相互影响，应该考虑到了。

Q10: 用慢病毒来包装siRNA来转染细胞，如何确定转染成功的细胞具有稳定性？这种细胞最多能够稳定传代多少代啊？

A10:我理解你的稳定性是指在子代细胞中也同样出现RNAi效果。瞬时转染的siRNA会在培养传代过程中，不断被降解稀释，以至消失。如果需要在子代中也永久有RNAi，必需将相关siRNA基因整合到细胞基因组中，并表达。一般来说，如果感染并传代2周以后，RNAi效应仍然非常明显，可以初步认定是稳定的。稳定传代的细胞系根据细胞的不同，可以传很多代的。

Q11: NCBI里查到的目的基因有3个mRNA,但是合成siRNA只能选择其中一条mRNA , 目前已有的文献也没有做这个的，该如何选择呢？

A11: 3个mRNA可能至少产生3个蛋白，研究哪个蛋白就选和这个蛋白相关的mRNA，如果不产生蛋白，就根据独立的功能对应的mRNA来研究，如果是研究这个基因的全部功能，就分各个mRNA来分别研究。

Q12: 阴性对照应该是与目的基因的序列无同源性的，那如何评价转染效率？

A12: 带荧光的siRNA，不考虑序列，转染进去细胞内即可出现荧光，故可用于优化转染条件和评估转染效率。而沉默效率则和siRNA序列相关。

Q13: 请问细胞水平实验，选择载体表达的shRNA还是小片段的siRNA?
请问两种在转染效率和沉默时间等有什么区别呢？

A13:根据实验需要沉默的时间来确定是用shRNA还是siRNA，1周以内的短期抑制，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长，缺点的需要构建相关载体。效率上，根据具体细胞，实验情况，各有千秋。

Q14: 转染后背景很脏，都是黑点（疑似黑焦虫）在原地运动。做了LB检测，确定该黑点不是细菌，最后发现黑点来源于抽提的质粒，请问有什么办法可以解决吗？

A14: 这种黑点，如果确定不是细菌，多是凝聚的蛋白，还有DNA等的沉淀产物，有人又把它叫“黑胶虫”。人们看到可以动，认为是生物，其实只是布朗运动。这和血清、细胞、转染试剂等都有关系。如果不影响实验，可以通过换液来除去。

Q15: 慢病毒转染多长时间后进行干扰目的基因和蛋白的检测？

A15:如果用慢病毒进行瞬时表达，一般至少需要24-48小时，慢病毒基因组是RNA，需要反转录成DNA，再生成siRNA，再干扰，才会发生作用。这个过程和细胞类别、细胞活性、慢病毒具体载体等等有关系。建议取不同时间点检测。另外，慢病毒一般都带筛选基因，可以考虑做稳定表达。如果只做瞬时表达，可考虑用转染试剂，成本、时间、方法都要省很多。

Q16: 21nt,22nt,24nt的siRNA如何进行电泳分辨？

A16:PAGE分析，即聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以分辨1bp，实际上，在引物的纯化中也常用此种凝胶进行纯化。但由于siRNA很容易降解，尤其在电泳时，需要接触的液体、器皿等都很多，很容易造成在电泳过程中的降解，这样电泳就不易分辨了。如果一定需要分辨，可以采用HPLC或质谱的方法。

Q17: RNAi很容易降解，转染效率很低。EntransterTM产品一般采用什么策略和技术来防范呢？

A17:RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后不被溶酶体降解，并能释放到细胞质中。好的转染策略还不仅有保护的作用，更重要的是浓缩siRNA，不将细胞外的其他成分，特别是毒性成分，如抗生素、过多的蛋白带入细胞，以避免细胞产生毒性反应，毒性对RNAi实验来说，影响非常大。

E. cell signaling technology 的sirna怎么样

产品使用信息
CST 建议转染 100 nM SignalSilence® siRNA 48 至 72 小时后，再进行细胞裂解。对于转染流程，请遵照转染试剂制造商提供的实验步骤。如有任何使用问题，请随时联系 CST。
每个小瓶含有相当于 100 次转染的用量，对应于每次转染时 24 孔板中的最终 siRNA 浓度（100 nM），每个孔的总量为 300 μl。
存储：
SignalSilence® siRNA 保存在无 RNA 酶的水中。分装并保存在 -20ºC 下。
产品说明
Cell Signaling Technology (CST) 的 SignalSilence® siRNA 能让研究人员使用 RNA 干扰特异性地抑制 靶基因表达，这种方法通过将双链 RNA 分子递送到细胞内使基因表达选择性沉默。CST 的所有 SignalSilence® siRNA 产品均已经过严格的内部测试，并且蛋白质印迹分析表明可降低靶蛋白表达。
质量控制
通过三苯甲基分析来逐个碱基地监视寡核苷酸合成，以确保合适的偶联效率。随后通过亲和固相萃取来纯化寡核苷酸。使用质谱分析法进一步分析退火的双链 RNA，从而验证双链的确切组分。使用质谱分析法将每个批次与上一批次进行对比，以最大程度确保批间一致性。

F. siRNA 生物合成和化学合成有什么区别吗

就可以自行解决所有问题你以上的这些问题。 1，要增加RNA体内或者体外转染的次数。 2、siRNA的化学合成。 4。 3、可以直接注射。时间比较长的话、可以、一般基因沉默效果在72h内检测，但是最后用脂质体等加以包裹，许多转染试剂都可以用于siRNA的转染至细胞，以防RNA被降解，只要看1-2篇文献，一般德国dharmacon或者美国的Ambion产品

G. 化学合成的SiRNA能直接注射到动物吗

你以上的这些问题，只要看1-2篇文献，就可以自行解决所有问题。
1、可以直接注射，但是最后用脂质体等加以包裹，以防RNA被降解。
2、可以，许多转染试剂都可以用于siRNA的转染至细胞。
3、一般基因沉默效果在72h内检测。时间比较长的话，要增加RNA体内或者体外转染的次数。
4、siRNA的化学合成，一般德国dharmacon或者美国的Ambion产品。