質粒資料庫

A. 在哪裡可以找到各種載體的序列啊

ncbi有資料庫 ，zmbl也可以。

載體（Vector） ，指在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質粒、噬菌體和動植物病毒。

在實際生活中，胰島素就可以通過使用載體將已插入胰島素基因片段的質粒放入大腸桿菌內。經過插入基因片段的質粒就稱作載體。該質粒在細菌內可以進行自我復制，並且不會影響到生物原來的活動。

質粒載體

質粒載體是一種相對分子質量較小、獨立於染色體DNA之外的環狀DNA(一般有1～200 kb左右，kb為千鹼基對)，有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。質粒能通過細菌間的接合由一個細菌向另一個細菌轉移，可以獨立復制，也可整合到細菌染色體DNA中，隨著染色體DNA的復制而復制。

噬菌體載體

利用噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，並隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。

B. 如何設計質粒

網路文庫搜索質粒構建和引物設計即可，很詳細。
引物設計的原則
引物設計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避 免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即 錯配)。
具體實現這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度 （proct length），序列Tm 值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性 (internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（plex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的 GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。根據有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點：
1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延 伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應[2]。
2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導 致錯配。引物3』端出現3 個以上的連續鹼基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發機率增 加[2]。
3. 引物3』端的末位鹼基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配 位置導致不同的擴增效率，末位鹼基為A 的錯配效率明顯高於其他3 個鹼基，因此應當避免在引物的3』端使用鹼基A[3][4]。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5』端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟體中使用的是最鄰近法(the nearest
neighbor method) [6][7]。
6. ∆G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用3』端∆G 值較低（絕對值不超過9），而5』端和中間∆G 值相對較高的引物。引物的3』端的∆G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA 聚合反應[6]。
7. 引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行[8]。
8. 對引物的修飾一般是在5』端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載 體的相應序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC
2
含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因為產 物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條 件。
引物的自動搜索和評價分析
軟體的引物設計功能主要體現在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數 商業版軟體能夠做到，其中以「Oligo 6」最優秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟體在 這方面的側重點不同，因此自動搜索的結果也不盡相同。據筆者的經驗，自動搜索功能以 「Premier Primer」為最強且方便使用，「Oligo 6」其次，其他軟體如「ector NTI Suit」、「Dnasis」、「Omiga」和「Dnastar」都帶有引物自動搜索功能，但搜索結果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自動搜索的基礎上還要輔以人工分析。筆者認為引物設計軟體 的最佳搭配是「Oligo」和「Premier」軟體合並使用，以「Premier」進行自動搜索，「Oligo」 進行分析評價，如此可快速設計出成功率很高的引物。
Primer Premier 5.0 的使用技巧簡介
1. 功能
「Premier」的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設計( )、
限制性內切酶位點分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。「Premier」還具有同源
性分析功能（ ），但並非其特長，在此略過。此外，該軟體還有一些特殊功能，其中
最重要的是設計簡並引物，另外還有序列「朗讀」、DNA 與蛋白序列的互換（ ）、
語音提示鍵盤輸入（ ）等等。
有時需要根據一段氨基酸序列反推到DNA 來設計引物，由於大多數氨基酸（20 種常見 結構氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時，會 遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計並合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡並引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。「Premier」可以針對模板DNA 的來源以相應的遺傳密碼規則轉換DNA 和氨基酸序列。軟體共給出八種生物亞結 構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、無脊椎動物線粒 體（Inertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標准（Standard）、脊椎動物線粒體（ertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步驟及技巧
「Premier」軟體啟動界面如下：
其主要功能在主界面上一目瞭然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點分析及基元查找功 能比較簡單，點擊該功能按鈕後，選擇相應的限制性內切酶或基元（如-10 序列，-35 序列 等），按確定即可。常見的限制性內切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新 限制性內切酶或基元。
進行引物設計時，點擊按鈕，界面如下：
進一步點擊按鈕，出現「search criteria」窗口，有多種參數可以調整。搜索目
的（Seach For）有三種選項，PCR 引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）
等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。如果沒有特殊要求，建議使用默認設置。然 後按，隨之出現的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時，再按， 這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物 (Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，並按優劣次序（Rating）排列，滿分 為100，即各指標基本都能達標（如下圖）。
點擊其中一對引物，如第1#引物，並把上述窗口挪開或退出，顯示「Peimer Premier」
主窗口，如圖所示：
該圖分三部分，最上面是圖示PCR 模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些
5 性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引 發情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當所分析的引
物有這四種結構的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的
窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最 好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。
在需要對引物進行修飾編輯時，如在5』端加入酶切位點，可點擊，然後修改引物序列。若要回到搜索結果中，則點擊按鈕。
如果要設計簡並引物，只需根據源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規
則，反推至DNA 序列即可。對簡並引物的分析不需像一般引物那樣嚴格。
總之，「Premier」有優秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標的分析，而且容易
使用，是一個相當不錯的軟體。
Oligo 6.22 使用技巧簡介
1. 功能
在專門的引物設計軟體中，「Oligo」是最著名的。它的使用並不十分復雜，但初學者容
易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個圖：Tm 圖和ΔG 圖；Oligo .22 的界面更復雜，出現三個圖，加了個Frq 圖。「Oligo」的功能比「Premier」還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至於能風靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 為例）
Oligo 6.22 的啟動界面如下：
圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6
至7 個鹼基組成的亞單位在一個指定資料庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發6的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同於Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。
經過Windows/Tili 項後的顯示如圖：
在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm 圖塊上左 下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選 取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。∆G 值反映了序列與模板的結
合強度，最好引物的∆G 值在5』端和中間值比較高，而在3』端相對低（如圖：）
Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5』到3』的下降形狀也有利於引物引發聚合反應。Frq 曲線 為「Oligo 6」新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用3』端Frq 值相對較低的片段。
當上下游引物全選好以後，需要對引物進行評價並根據評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3』端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值 越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；
與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5 為好。 當然，在設計克隆目的的PCR 引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構， 而且能值不會太低。這種PCR 需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾 結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC 含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利於退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基 因組DNA，而是一個特定模板序列，那麼最好還進行False priming site 的檢測。這項檢查可以看出引物在非目的位點引發PCR 反應的可能性。如果引物在錯配位點的引發效率比較 高，就可能出假陽性的PCR 結果。一般在錯配引發效率以不超過100 為好，但對於特定的7
8
模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的 引發效率為450 以上，而在錯誤位點的引發效率為130，那麼這對引物也是可以接受的。
當我們結束以上四項檢測，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結性地顯示該引物的位
置、產物大小、Tm 值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。
由於「Oligo」軟體的引物自動搜索功能與「Primer Premier 5」的相類似，並且似乎並
不比後者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟體自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求
去尋找最佳引物，如果參數設置得當將大大提高工作效率。

C. 怎麼找到一個質粒的基因圖譜啊質粒是pcDNA3.1,謝謝啦！怎麼能從NCBI上查到呢/

這是我剛做的作業：在NCBI網站上找到大腸桿菌、釀酒酵母、斑馬魚的基因組圖譜，並將操作步驟和查找的結果截圖。
首先，打開NCBI主頁進入genome資料庫。

然後在網路上 搜索物種的拉丁名 輸入到 for
1， 大腸桿菌：Escherichia coli

任意選擇一個基因 比如打開 NC009436 結果如下

D. 質粒抽提後，進行測序，想看一下多克隆位點序列。在與GenBank資料庫比對時，發現差異好大，請問如何比對

請問你是用質粒上多克隆位點附近的引物進行的測序嗎？由於測序結果頭部序列會受到熒光染料干擾會有幾十BP序列不是很准確，你需要雙向測序後進行拼接，連成一條鏈後再在資料庫比對，或者是網上下載DNASTAR之類的比對軟體來分析比對。

E. 如何用電腦軟體繪制質粒圖譜

一個合格質粒的組成要素 復制起始位點Ori，即控制復制起始的位點。原核生物DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA 分子有多個復制起始位點。 抗生素抗性基因：可以便於加以檢測，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位點：MCS 克隆攜帶外源基因片段 P/E：啟動子/增強子 Terms：終止信號 加poly（A）信號：可以起到穩定mRNA 作用 。

二、如何閱讀質粒圖譜

第一步：首先看Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒） Ori 的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉錄方向（正向）。

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什麼篩選標記：

（1）Ampr：水解β -內醯胺環，解除氨苄的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四環素進入細胞。

（3）camr：生成氯黴素羥乙醯基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那黴素衍生物）失活。

（5）hygr：使潮黴素β 失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點，便於外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便於篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質粒一般只能容納小於10Kb 的外源DNA 片段。

F. 現有一質粒，如何用Vector NTI分析該質粒的抗性

假設現在只知道序列而不知道質粒名
使用Alberta大學的在線程序PlasMapper，輸入序列之後確保Feature Options裡面Selectable Marker選中（其它選項不需要都可以去掉）。點擊Graphic Map生成質粒圖譜，如果出現標記kan2 marker就是卡那抗性。

另一種方法是去NCBI做BLAST使用nucleotide blast選擇nucleotide collection資料庫，找到最相近的載體名，然後去/google相應的載體圖

G. miRNA構建在質粒上是用miRNA的什麼序列，cDNA還是在染色體上的基因序列，在什麼地方查

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，目前發現的數量就那麼幾條，從基因組DNA上轉錄下來，經過兩次剪接，成為成熟的MiRNA。
給你三個資料庫和軟體：
miRbase：microRNA基因注釋資料庫。目前miRBase只提供了microRNA的靶標的預測軟體的鏈接（如：PicTar）。

Tarbase：一個收集已被實驗驗證的microRNA靶標資料庫。
PicTar：基於microRNA或microRNA靶標聯合作用等特徵開發的搜尋動物的microRNA靶基因的軟體，假陽性率也較低。

H. 大家知道，NCBI質粒資料庫中這每一個壓縮文件表示什麼，他們是不同的質粒資料庫么求解答

DriverManager // static { try { java.sql.DriverManager.registerDriver(new Driver()); } catch (SQLException E) { throw new RuntimeException("Can't register driver!"); } } 原來，Driver在static塊中會注冊自己到java.sql.DriverManager。

I. 為什麼質粒天然存在

什麼是質粒，質粒（plasmid）存在於許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子。網路，對於和DNA、蛋白、微生物打交道的同學來說，質粒是相當常見的東西，如定義所說，質粒是一種小型環狀DNA分子。質粒常用於搭載外源基因，導入受體菌種，進行蛋白表達。老簏見過或者聽說過的質粒沒有100 也有80，而實際用過的只有10來種。在目前Addgene質粒資料庫中，已經收藏了大約45000種質粒，有的質粒是天然的，有的是人為設計的；有的適用於微生物，有的則是用於更高級細胞；有「無限」復制的pUC系列，也有兄弟眾多的pET系列。總之質粒種類繁多，變化多樣，在接下來的內容中，我們就來聊聊，一般的用於微生物表達的質粒有哪些特點。任質粒如何變化，老簏認為，有四個方面信息是我們在選擇質粒之前應該考慮的：復制源（origin of replication）、復制能力（ number）、抗性選擇（antibiotic resistance）和與其他質粒的兼容（incompatibility）。復制源--origin，pBR322，這是最早適用於大腸桿菌E.coli分子克隆的質粒，至今仍然有很多人在用pBR322及其衍生版本。pBR322（GeneBank accession: J01749.1）是由兩名墨西哥科學家Boliver (B) 和Rodriguez (R) 於1977年設計的，長度在4.5kb左右，包含一個復制源序列（rep）、一個rop蛋白序列、一個Ampicilin抗性片段（AmpR）和一個tetracycline抗性片段（TetcR）。rep復制起點序列是質粒上十分重要的一個組成部分，它誘導宿主細胞啟動DNA復制機制，使得質粒本身得以復制。pBR322的復制起點序列被稱為pMB1，而這里的pMB1並不是一個能誘導極高復制能力的起點，但也可以保證每個宿主細胞包含15-20個質粒。

J. 基因組資料庫的線蟲資料庫

AceDB是線蟲(Caenorhabditis elegans)基因組資料庫。需要說明的是，AceDB既是一個資料庫，又是一個資料庫管理系統。AceDB基於面向對象的程序設計技術，是一個相當靈活和通用的資料庫系統，可用於其它基因組計劃的數據分析。AceDB最初是基於Unix操作系統的X窗口系統，適用於本地計算機系統。AceDB提供很好的圖形界面，用戶能夠從大到整個基因組小到序列的各個層次觀察和分析基因組數據。新開發的WebAce和AceBrowser則是基於網路瀏覽器。Sanger中心已經將其用於線蟲和人類基因組資料庫的瀏覽和搜索。庫內的資源包括限制性圖譜，基因結構信息，質粒圖譜，序列數據，參考文獻等等。