php層析

A. 疏水層析的相關知識

在
丁香園
生物網路
（
http://dxy.ac.cn
）
總結
：
離子交換
層析：
http://dxy.ac.cn/wiki/viewthread.php?tid=458&
highlight
=%C0%EB%D7%D3%BD%BB%BB%BB
離子交換層析
離子交換層析是利用
離子交換劑
上的
可交換離子
與周圍介質中被分離的各種離子間的親和力不同，經過交換平衡達到分離的目的的一種柱
層析法
。該法可以同時分析多種
離子化合物
，具有靈敏度高，重復性、選擇性好，分離速度快等優點，是當前最常用的層析法之一，常用於多種離子型
生物分子
的分離，包括蛋白質、氨基酸、多肽及核酸等。
離子交換層析對物質的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃交換劑的
玻璃管
中進行的。離子交換劑為人工合成的多
聚物
，其上帶有許多可電離基團，根據這些基團所帶電荷的不同，可分為
陰離子交換劑
和
陽離子交換劑
。含有預被分離的離子的溶液通過
離子交換柱
時，各種離子即與離子交換劑上的
荷電
部位競爭結合。任何離子通過柱時的移動速率取決於與離子交換劑的親和力、電離程度和溶液中各種競爭性離子的性質和濃度。
離子交換劑是由基質、荷電基團和
反離子
構成，在水中呈不溶解狀態，能釋放出反離子。同時它與溶液中的其他離子或離子化合物相互結合，結合後不改變本身和被結合離子或離子化合物的理化性質。
離子交換層劑與水溶液中離子或離子化合物所進行的
離子交換反應
是可逆的。假定以RA代表陽離子交換劑，在溶液中
解離
出來的陽離子A＋與溶液中的陽離子B＋可發生可逆的交換反應：RA+B+↔RB+A+；該反應能以極快的速度達到平衡，平衡的移動遵循
質量作用定律
。
溶液中的離子與交換劑上的離子進行交換，一般來說，。。。。
疏水作用
層析，建議看看這個，或者搜索
http://dxy.ac.cn/wiki/viewthread.php?tid=461&highlight=%CA%E8%CB%AE
參考資料：http://dxy.ac.cn/wiki/viewthread.php?tid=183&highlight=%C0%EB%D7%D3%BD%BB%BB%BB

B. 物理學的發展史

近代意義的物理學誕生於歐洲15—17世紀。人們一般將歐洲歷史作為物理學史的社會背景。從遠古到公元5世紀屬古代史時期；5—13世紀為中世紀時期；14—16世紀為文藝復興運動時期；16—17世紀為科學革命時期，以N.哥白尼、伽利略、牛頓為代表的近代科學在此時期產生。

從此之後，科學隨各個世紀的更替而發展。近半個世紀，人們按照物理學史特點，將其發展大致分期如下：從遠古到中世紀屬古代時期。從文藝復興到19世紀，是經典物理學時期。牛頓力學在此時期發展到頂峰，其時空觀、物質觀和因果關系影響了光、聲、熱、電磁的各學科。

甚而影響到物理學以外的自然科學和社會科學。隨著20世紀的到來，量子論和相對論相繼出現；新的時空觀、概率論和不確定度關系等在宇觀和微觀領域取代牛頓力學的相關概念，人們稱此時期為近代物理學時期。

(2)php層析擴展閱讀：

伽利略·伽利雷（1564~1642年）人類現代物理學的創始人，奠定了人類現代物理科學的發展基礎。1900~1926年 建立了量子力學。1926年 建立了費米狄拉克統計。1927年 建立了布洛赫波的理論。1928年 索末菲提出能帶的猜想。1929年 派爾斯提出禁帶、空穴的概念。

同年貝特提出了費米面的概念。1947年貝爾實驗室的巴丁、布拉頓和肖克萊發明了晶體管，標志著信息時代的開始。1957年 皮帕得測量了第一個費米面超晶格材料納米材料光子。1958年傑克.基爾比發明了集成電路。20世紀70年代出現了大規模集成電路。

發展前景：

應用物理學專業的畢業生主要在物理學或相關的科學技術領域中從事科研、教學、技術開發和相關的管理工作。科研工作包括物理前沿問題的研究和應用，技術開 發工作包括新特性物理應用材料如半導體等，應用儀器的研製如醫學儀器、生物儀器、科研儀器等。

應用物理專業的就業范圍涵蓋了整個物理和工程領域，融物理理 論和實踐於一體，並與多門學科相互滲透。應用物理學專業的學生如具有扎實的物理理論的功底和應用方面的經驗，能夠在很多工程技術領域成為專家。我國每年培養本科應用物理專業人才約12000人。

和該專業存在交叉的專業包括物理專業，工程物理專業，半導體和材料專業等。人才需求方面，我國對應用物理專業的人才需求仍舊是供不應求。

C. 急需以下物質的分析方法。氣相或者液相。

我是學分析化學的
你說的這些東西最好的分析方法是用液相色譜法
具體的分析很復雜,其原理相當於高中生物書上葉綠素的分離.

下面是詳細的說明
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
特點

1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。
3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於 400 以上）的有機物（這些物質幾乎佔有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約佔20%，而能用液相色譜分析的約佔70～80%。

高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜法的主要類型及其分離原理
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：

1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於下式：

式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。

b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。

c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色譜法

流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。

當吸附競爭反應達平衡時：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]

3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：

X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中)

當交換達平衡時：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系數為：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[討論：DX與保留值的關系]

凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。

4 ．離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)

離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相

式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。

當達平衡時：

KXY = [X+Y-]有機相/[ X+]水相[Y-]水相

根據定義，分配系數為：

DX= [X+Y-]有機相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[討論：DX與保留值的關系]

離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。

5 ．離子色譜法(Ion Chromatography)

用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。

以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：

抑制柱上發生的反應：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。

離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)

空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。

高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、．分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。

1．進樣系統

一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

2．輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。

3.分離系統

該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。

再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

4．檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。

（1）紫外檢測器

該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測器

凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g／ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。

（3）熒光檢測器

凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。

（5）數據處理系統

該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

D. 氨基酸纖維素薄層層析的展開劑中冰醋酸有什麼作用

沒有重大差別。用紙做層析，效果重復性相對差一點，對分離物的吸附性更強一些，需要用極性比較大一些的劑進行操作。這是與用硅膠進行TLC分離相對比而言的。

E. 請問什麼是活性的超氧化物歧化酶，人工是如何製造出來的

超氧化物歧化酶(SOD) 超濾法生產新工藝

前 言

SOD的中文名稱是超氧化物歧化酶，其英文名為Superoxide dimutase，分子量(牛血紅細胞) 約 32000 是廣泛存在生物體內的金屬蛋白醇 ， 別名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科學家譽為21世紀最有發展前途的葯用酶。

一、本工藝是從紅細胞，肝和其它哺乳動物組織分離而得的金屬酶；含兩個亞基，每個亞基各含一個銅原子和一個鋅原子，SOD可催化O2，歧化為H2O和O2， 其性質不僅僅取決於酶蛋白，而且還取決於活性部位的金屬離子，按金屬離子類型不同， 可分為Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三種.在一般條件下，SOD較穩定. 不同來源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光譜略有差異，如牛血SOD在258nm處顯示最大吸收，而豬血SOD的最大吸收峰為265nm，在特定條件下，酶的活性可下降，甚至完全喪失， 如氰化物可抑制SOD活性，雙氧水使SOD活性下降，氯化胍能明顯抑制SOD活性等。

二、SOD用途主要是基於SOD是超氧陰離子清除劑，超氧陰離子(O2~)是人體內有毒物質，它能引起多種疾病，故能清除炎症過程中伴同產生的超氧離子， 而顯示出強大的抗炎作用。

在醫葯工業：SOD可以治療由於超氧離子引起的各種疾病，如糖尿病，白內障， 風濕性關節炎等，也是消炎的有效葯物，而且還能抗衰老，抗腫瘤，抗輻射， 抗自身免疫疾病，現代研究表明：SOD還能治高血壓，冠心病，膽囊炎，肺氣腫等難治之症. 日用化學工業：由於SOD有防止細胞老化和解毒等功效， 因此在化妝品和護膚劑等工業產品中，添加SOD之後，具有防曬，祛斑，使皮膚柔嫩的作用.是目前化妝品行業中不可缺少的一種添加劑，國內及同行都已出現大量產品.食品工業：在食品添加劑加 SOD之後，增強營養，解除毒性，延長體內細胞壽命，國內已有SOD營養液產品， 並通過上海科研單位有關專家的鑒定。

三、SOD的開發前景：目前SOD在全國僅有少數科研單位及生化制葯廠研究和開發本產品，而使用SOD產品廠家卻日益增多，遠不能滿足市場需求 . 為鼓勵和大力開發SOD新產品，國家已將其列入重點科技開發項目，並投放大批經費，現已獲得成功， 開始向企業化生產轉移，市場前景十分廣闊。

四、注意事項：(1)我中心熱忱歡迎社會各界朋友現場學習，由生化工程師向您授課，通過現場操作，指導，培訓，使您盡快掌握該技術。(2)本工藝， 技術資料等不經我公司同意，不得擅自轉讓，翻印，銷售給任何單位和個人，違者法律追究。

新法提煉技術

一、主要設備：(1)工業用離心機一台；(2)恆溫水浴鍋(10L--50L)(可自製)1台；(3)冰櫃1台；(4)攪拌機1台；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml燒杯各3隻，50ml燒杯 2 只，50ml，500ml量杯各1個；(6)塑料桶若干個。

二、主要試劑：(工業純度)檸檬酸鈉，檸檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，去離子水或蒸餾水，葡萄糖凝酸膠SephadexG-- 100 和DEAE--纖維素.

三、試劑的配製：

1.抗凝劑配方：(1)檸檬酸鈉30g，檸檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，一般此種是每7ml血液，加1ml(抗凝劑).(2)40g/升檸檬酸鈉溶液：在1升水中加入0.9克的氯化鈉。

2.生理鹽水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化鈉。

3.磷酸鹽緩沖溶液的配製：PH7.6，0.2M磷酸鹽緩沖溶液，一般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，後者加13.0ml混合後即為PH=7.6 緩沖溶液，如果用K2HPO4.3H2O為45.644g/升，NaH2PO4.2H2O為31.21克/升，仍是前者87.0ml，後者13.0ml混合後即得。

4.冷卻劑：在本工藝中有使用-15度低溫，一般用如下配方：用33克食鹽加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合體可達-21.3度。

四、工藝流程

(一)除血紅蛋白

1.血液抗凝處理，在新鮮牛、馬、豬血中迅速加入ACD1號抗凝劑，並緩慢攪勻，每7毫升血液中加入抗凝劑1毫升或2號抗凝劑。

2.把抗凝處理的血液放入離心機，以3000r/min離心約15--20分鍾， 用吸管把上清液(黃色血清)小心吸去拋掉，下層的紅血球用2--3倍生理鹽水洗2--3次，在每一次洗滌中，用離心機以3000r/min離心，7--8分鍾，反復操作後，得到洗滌血紅細胞，洗滌後的血紅細胞在-15度下冷凍可保存半年並不影響產率和比活，在血液量大， 處理不完時必須這樣做。

3.在洗凈的紅血球中加入等體積去離子水，劇烈攪拌30分鍾，使紅血球細胞壁砍碎，以使其內的SOD浸出.最好在0--4度靜止過夜後，把溶血進行有機提取。

4.接著向溶血中緩緩加入0.2--0.25倍體積的預冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍預冷氯仿，攪拌10--15分鍾後，原溶血呈漿糊狀，靜止1--2小時，用濾布除去凝固的血紅蛋白，然後將濾液2500r/min離心約1--5分鍾留上清液拋去沉澱， 此時如果上清液略為微黃色時，可用快速過濾紙過濾，可得到微帶藍色的清澈透明的粗酶液。

(二)粗酶液的初步提純：

1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量預冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沉澱 ， 以3000r/min離心2分鍾收集沉澱，上清液可不必吸取，直接傾倒。

2.熱變性：(除雜蛋白)准備好衡溫浴鍋，在本工藝中，提前30分鍾， 注滿水接通電源後，使之加熱到55--60度以省時間，將沉澱量約50倍量體積比加入0.2MPH=7.6磷酸鈉緩沖溶液，水浴加熱至60度，15分鍾後迅速冷卻到室溫.3000r/min離心2 分鍾得上清液，在上清液中，緩緩滴加0.6倍體積的預冷(-15度)丙酮，生成白色沉澱。

3.初純SOD：在上述沉澱中加去離子水，製成20--30%SOD溶液，分裝入樣品瓶中，放入冷凍乾燥機中，於開機後以0.2--0.1Torr真空度，約1.5--2小時， 得到化妝或食品用SOD，該產品比活大於3000u/mg，外觀呈微帶藍色的白色凍干品。

(三)SOD進一步提純：

SOD精品一般是把SOD產品經過柱層析，柱層析後的SOD沒有小分子等雜質， 層析後為高活性的SOD大分子.SOD精品價格更高，它主要作為生物化學試劑， 化驗室標准試劑試用.目前SOD柱層析有兩種，二者可單獨使用，也可結合使用，一般是DEAE-- 纖維素層析和SephadcxG--100葡聚糖凝膠層析，將(二)2，熱變性後SOD丙酮沉澱用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4緩沖溶液溶解，有不溶的雜蛋白時.離心拋去沉澱，上清液上DEAE--纖維素或SephadsxG--100層析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脫 ， 洗脫液為PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4緩沖液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度計上用紫外譜325nm處測流出液，合並活力峰，再用蒸餾水反復透析，透析徹底後， 放入樣品皿置於冷凍乾燥機中乾燥後即得SOD精品。

五、注意事項：

1.掌握適當的溫度和時間：雖然SOD對熱較穩定， 但在分離純化過程中最好還是採用較低溫度，一般以0--10度為宜，時間長不要超過3天。

2.注意提取，提純方法：使用有機溶劑或者加熱均能有效沉澱蛋白質， 但掌握適當溶劑和加熱結合的辦法可以達到最佳效果。

六、SOD的檢測方法：活性檢驗，比較方便的辦法是用連笨三酚自氧化法， 先測得連笨三酚的自氧化速率，然後加入SOD再測得加入SOD之後的氧化速率，按照酶活性單位定義，即在最佳條件下，每分鍾抑制連笨三酚自氧化分解速率達50% 的酶量定義為一個酶單位.依次求出活力總值 ，同時也可以用聚丙烯醯胺凝膠電泳來測定其純度，看其分子量32000左右的一條帶是否與有關文獻指導一致.

超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 簡稱SOD)是一種重要的氧自由基清除劑，作為一種葯用酶，引起國內外生化屆和醫葯屆的極大關注。SOD應用於醫學臨床上可以治療多種疾病，類風濕性關節炎、心肌梗塞等，在防輻射，抗衰老，抗腫瘤等方面也有積極的作用，而且廣泛用於化妝品和食品添加劑的行列。

自1969年Mccord和Fridovich 首次發現從牛血細胞中發現超氧化物岐化以來，到目前為止，國內已有幾十家科研單位對SOD作了大量的研究和試產工作，而且有些已批量生產。SOD引起了國內生化界的重視，1988年在浙江寧波如開了《全國首屆SOD學術會議》。1989年4月在河南開封《第三屆葯用酶學術會議》上，SOD被列為重點開發項目，90年7月在大連《全國第二屆SOD學術會議》，SOD已作為一種葯用酶發展較快，將成為一種很有前途的生化產物。

SOD是一種廣泛存於動物、植物和微生物的生物酶，國外葯用SOD系從血中提取，國內SOD已開發的品種已超過20種，證明我國對SOD的研究和應用已進入新時期。

我國從牛、馬、豬、雞、狗等動物血中提取SOD來源豐富，成本低，提取和純化較方便，葯細胞膜易破，用常規分離純化法可獲得高純度的SOD。

本技術採用熱變性，超濾新技術，不僅大大簡化了工藝過程，而且產品質量和收率都比老工藝有較大的提高，其提取的SOD均為CuZu-SOD。

一、葯品與儀器：

(1)檸檬酸三鈉：Na3C6H6O7 (2)工業丙酮CaH6O

(3)鄰苯本酚 (4)酸磷鉀K3Poe4

(5)弱鹼性陰離子交換劑DEAE Sephadsxa-50外觀40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纖維素。 (6)冷凍乾燥器(自己組配)

(7)層折柱(7.5＊30cm) (8)離心機

以上試劑及其它葯劑、儀器可在各省市化學試劑商店、醫療器械商店購買。

二、Cu、Zu-SOD的提取及純化(牛、馬血為例)

1、工業流程：

加抗凝劑 鹽洗

鮮牛血--------------------->紅血球------------------------>

離心除黃色血漿 加NaCL

熱變性1 熱變性2

壓積紅細胞-------------->淡黃色混合液--------------------->

68度30分鍾 60-65度20分鍾

加丙酮 加丙酮 層析

淺藍色清液----------->絮狀沉澱-------------->沉澱------------>

凍干

透析除鹽

洗脫----------------->透析液--------->SOD(凍干品)

2、提取方法

(1)收集紅細胞：鮮牛血100升，加入3. 8％檸檬酸三鈉抗凝劑攪拌均勻，靜置，使紅細胞自然沉降，除去上層大部分血漿，下層液再離心除盡其餘血漿，再加入3倍量0.9％氯化鈉(精製食鹽)洗滌兩次， 離心可收集到壓積紅細胞(40升)。

(2)熱變性1：收集的紅細胞再加入4公斤氯化鈉，40克氯化銅，蒸餾水100升攪勻，水浴加熱到68度恆溫30分鍾，迅速冷卻加至室溫，過濾除沉澱，收集濾液。

(3)熱變性2：濾液在65度恆溫水浴下，向濾液中慢慢中入40克氯化銅，至濾液清澈變為淡藍色為止，保溫20分鍾，迅速冷卻至室溫，離心去沉澱得上清液。

(4)SOD粗品：超濾心清液加入0.75倍全積的丙酮沉澱， 離心收集沉澱於離於水，離心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍體積的丙酮沉澱， 離心收集沉澱，沉澱經無水丙酮洗滌脫水兩次，真空乾燥得淡藍色粉末狀SOD粗品

(5)SOD粗品提純：SOD粗品溶於2.5mmol/L，PH值7.6磷酸鉀緩沖液，將該混合液上在7.5＊30cm的層柱上，離子換劑為DEAE-SphadexA-50(該柱事先用緩沖平衡)，以100～200ml/小時速度上樣，完畢後用同一緩沖A280mm值，低於0.02然後用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸鉀緩沖液進行直線梯度分段洗脫，流速為100ml/小時。用部分收集器收集， 洗脫液經透析除鹽後，得濃縮的透析液，經冷凍乾燥，得SOD成品，(呈淺綠色)。

三、SOD活性測定：

SOD的測定方法很多，常見的有化學法，免疫法等電點聚焦法等，化學法測定的原理主要是利用有些化合物如鄰苯三酚，在自氧化過程中會產生有色中間物降超氧游離基(O2)這樣就可以利用SOD分例(O2)。阻止中間物的積累而測定其酶活性。

1、試劑及儀器

(1)鄰苯本酚分析純，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度計。

2、測定方法：

(1)鄰苯三酚自氧化速度的測定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4緩沖液中加入10mmol/L的鄰苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯內，在325mm波長下每隔30秒測A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性測定：

測定方法同測鄰苯三酚自氧化速度，在加入鄰苯三酚前加入待測SOD樣液，測得數據按以下公式計算酶活性。

0.0700－A325mm/min

----------------------------------------＊100％度

0.70

樣液稀釋倍數 樣液稀釋倍數

酶活性(u/m1)＝------------＊反應液總體積＊----------------

50％ 樣液體積

3、蛋白濃度(mg/ml)和蛋白的計算：

SOD或粗酶抽提液，經280mm紫外比色測定後，查牛轎清白蛋的標准曲線，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白濃度＝ug蛋白/ml＊樣液稀釋倍數＊10負3次方＝mg蛋白/ml總蛋白＝mg蛋白/ml＊原液總體積＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的計算：

單位活力(u/ml) 總活力

比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白

蛋白的濃度(mg蛋白/ml) 總蛋白

四、Cu、Zn－SOD性質：

1、Cu、Z n－SOD呈藍綠色，分子量在3200左右，由兩個中一個Cu和一個Zn。

2、對熱穩定，天然牛血SOD，75度下加熱數分鍾其酶活喪失很小。

3、PH值對SOD的影響，SOD在PH5.3～10.5范圍內，其催化速度不受影響，PH3.6時SODZn脫落95％，PH12SOD構象發生不可遞的構象，導致酶活性喪失。

4、SOD的紫外線吸收特徵：SOD在280mm處沒有吸收高峰。

5、金屬輔其與酶活性。SOD屬金屬酶Zn僅於分子結構有關，而Cu與催化活性有關。

6、SOD是其具有還有和失活作用的。

五、葯品與儀器：

檸檬三鈉，分析純：江蘇花橋北工四廠；

工業丙酮：上海溶劑廠；

鄰苯三酚，分析純：貴州遵義化工廠；

六、SOD的包銷單位：

(1)河南鄭州國營聖科研究所鄭州南陽路14號 郵編：450053《河南科技報》91年10月3日

(2)四川省金堂縣工藝製品技校生化科接待室：金堂准口執行的院內，政府辦公大樓1樓 郵編：610404 聯系人：鄧勇 彭麗 《四川農村報》 91年3月1日

(3)廣東省深圳市上步區石夏東二蒼14號科技所 郵編：518031聯系人：黃秋林 《科技消息報》92年7月10日

說明：1、資料後附的產品銷售地址信息均為我們從近兩年的報刊上摘錄的各單位廣告，並註明有出處。

2、你先看完資料後，行根據自己的實際情況，先小量試驗， 並事先聯系好產品的收購單位，待取得經驗後再批量生產。

3、讀者在聯系收購單位時，請一定事先去聯系，並附上郵資， 待得到明確答復後再根據情況去人辦理，千萬不要冒然前往，以免造成不必要的經濟負擔。

4、原料及儀器各地經營原料店供應，廣州市人民南路，上九路等地均有供應。

附：詳細SOD收購信息

1、廣西南寧市生物化學制葯廠

地址：魯班路1號

2、上海生物化學制葯廠

地址：海主路513號

3、江蘇徐州市生物化學葯廠

地址：海沛路86號

4、山東兗州市生物化學制葯廠

地址：肉聯廠內

5、湖南常德生物化學制葯廠

地址：肉聯廠內

6、佛山市生物化學制葯廠

地址：佛山市

7、廣州市明興制葯廠

地址：廣州市河南路工業大道北48號

8、廣州市白雲制葯廠

地址：從廣州越綉公園坐21路車到三元里北展下車沿著礦泉別墅側入200米

9、哈爾濱生化葯廠哈肉聯廠

地址：哈爾濱道外南極街12號院；電話：88423轉制葯廠

10、沈陽市生物化學制葯廠

地址：哈爾濱皇姑區明廉路2號；

11、江蘇省南京生物制葯廠

地址：江蘇省南京市下關區寶塔橋附近；

12、浙江省金華生物化學制葯廠

地址：浙江省金華市河盤橋路51號

13、廣東生物制葯廠

地址：廣州市三元里

14、廣東汕頭市生物化學制葯廠

地址：湖山路西巷3號2號；電話：666124

11、江蘇省南京生物制葯廠

地址：江蘇省南京市下關區寶塔橋附近

12、浙江省金華生物化學制葯廠

地址：浙江省金華市河盤橋路51號

13、廣東生物制葯廠

地址：廣州市三元里

14、廣東汕頭市生物化學制葯廠

地址：湖山路西巷3號15.上海霞飛日用化工廠

16.北京麗源日用化工廠

17.南京化妝品廠

18.上海日用化學品二廠

19廣州美容化妝品廠

20南京第二葯物化學制葯廠

上海永芳日用化學品廠

廣州化妝品廠

杭州市鳳喜化妝品廠

上海日用化學品四廠

天津市津樂制葯廠

杭州第一生物化學制葯廠

上海葯物研究所實驗葯廠

天津市南開區美容化妝品廠

蘇州市昊縣生物化學廠

上海生物化學制葯廠

天津生物醫學技術開發中心

上海香海美容品廠

北京日用化學品四廠

武漢市辛安渡制葯總廠

湖北沙市生化制葯廠

北京市三露廠

注各大制葯廠化妝品廠美容院均為銷售對象

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F. 蛋白質的分離純化技術有哪些

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M，即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M，即 676 克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間，當用其他 pH 值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的 pH 位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

如果你有蛋白質純化方面的技術服務需求，可以來百替生物看看，網址是：http://www.100biotech.com/index.php