引物怎麼配置
① 關於PCR溶液體系的配製
加入量和濃度有關，只要知道每一個要加入物質的濃度就可以算出來了：
模板的體積=25ng/模板的濃度 （這個值需要測定，如果實在不知道模板濃度，就加0.1-0.5ul左右吧）
引物的體積=0.5umol/1000uL * 10uL / 引物濃度 （根據自己配製的情況，有時候可能是100mM或者是200mM）
Taq酶體積= 0.5 U / Taq 酶活力單位濃度（標注在管子上，U/uL表示的數字）
Buffer的量應該是1uL。（這里需要解釋一下，經過確認，沒有1X的buffer，因為如果是1X的話，沒法加了，所以正確的應該是10X的buffer，加入量就是稀釋10倍，所以10uL體系加1uLbuffer）
② 引物為100um，我要配置50l的體系，引物為20um。那我要加引物為10ul
搜一下：引物為100um，我要配置50l的體系，引物為20um。那我要加引物為10ul？
③ 熒光定量pcr時引物用depc水配置嗎
如果你想區分出你的cDNA是否有genomic DNA的污染，在設計熒光定量PCR引物時，最好跨越至少一個內含子吧
④ PCR體系怎麼配
PCR Buffer50 mM KCl, 10 mMTris-HCl, 2.5 mMMgCl2, pH 8.3
200μM dNTPs指25ul體系中的dNTPs的終濃度。
0.2 μM invA primers,0.2 μM終濃度的配對鏈引物。
0.2μM sefA primers, 0.2 μM終濃度的自身鏈引物(下游引物)。
and 0.5 μM pefA primers
2.5U of Taq DNA polymerase，2.5U的Taq酶，一般Taq酶都是5U/ul的。
and 0.2μl of DNA template，0.2ul DNA模板。
剩餘的體積用無菌水補足25ul。
(4)引物怎麼配置擴展閱讀
設計PCR 引物時的一般原則：
1、引物長度- 一般15~ 30鹼基，過短則特異性低; 過長則會引起引物間的退火而影響有
效擴增。
2、 避免內部二級結構，避免序列內有較長的迴文結構，使引物自身不能形成發夾結構。
3、G/C 和A/T 鹼基均勻分布，G/C 含量在45%~ 55% 之間，引物鹼基序列盡可能選
擇鹼基隨機分布，避免嘌呤、嘧啶的連續排列。
4、要避免兩個引物間特別是3' 末端DNA 序列互補以及同一引物自身3' 末端的序列互
補，使它們不能形成引物二聚體或發卡結構。
5、引物3' 端鹼基一般應與模板嚴格配對，並且3' 端為G、C 或T 時引發效率較高。
6、 引物5' 端鹼基可不與模板匹配，可添加與模板無關的序列(如限制性內切酶的識別
位點、ATG 起始密碼子或啟動子序列等)。
⑤ 如何設計含attb位點的pcr引物
使用Multisitegateway技術構建載體的方法 Multisite gateway 實驗步驟如下 設計含有attB位點的PCR引物建議使用Vector NTI Advance 軟體來設計含有attB和attBr的引物。 上游引物必須同時滿足以下條件 含有2225 bp的attB位點 至少1825 bp的模板或插入片段特異性的序列 multisitegateway引物序列的特異性 Fig specificsequences Multisitegateway 下游引物的設計也需滿足以上三個條件。 因為我們要在E coli 體內表達蛋白 所以設計上游引物時 要在attB位點之前加上SD Shine Dalgarno 序列來保證翻譯的准確性。同時為了保證閱讀框的正確性 需要在attB位點之前加上兩個核苷酸 但不能是AA AG和GA 因為它們會和attB位點末端的胸腺嘧啶核苷酸T形成終止密碼子。 得到PCR產物並電泳檢測PCR程序設置和電泳方法同上 需要指出的是 若PCR的模板是包含卡那抗性基因 kanamycin resistance gene 的質粒 需要在電泳檢測和純化PCR產物前對其進行消化 使用的酶是Dpn 作用是為了去除模板對後續反應的干擾。 消化的體系和過程 在50μl的PCR反應體系中 加入5 μl10X REact Dpn37 孵育15 min 65 熱激15 min使Dpn BP反應得到entryclone 反應體系如下 BP反應的引物組分Table BPreaction Components Sample Negative control positive control attB PCR proct 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW control plasmid 100 ng TEBuffer pH 其中攜帶attB位點的PCR產物的量可以用以下公式來計算 50 fmoles 2500 bp 660 fg fmoles ng106fg 82 PCRproct required 實驗步驟如下 按上面計算方法和反應體系加入合適體積的pDONRTMvector 和PCR產物 20冰箱里拿出BP Clonase II enzyme mix 放在冰盒上兩分鍾左右使其解凍。 輕輕渦旋BP酶兩次每次兩秒鍾 BPClonaseII enzyme mix 並立即將其送回 20 冰箱里 樣品輕輕渦旋幾次使其混合均勻。 25孵育1 蛋白酶K37 孵育10 min。 之後進入轉化環節後續實驗流程同經典載體構建 最終得到含有attL位點的entry clone。 LR反應組分Table LRreaction Component Sample Negative Control attL4 attR1entry clone 10 fmoles attL2entry clone 10 fmoles attR2 attL3entry clone 10 fmoles pDEST R4 R3 Vector II 20 fmoles TEBuffer pH 使用Infusion方法快速大量構建載體的方法 fusion是一種不依賴於限制性內切酶Restriction Free 的克隆方法 引入此方法的最初動機是為了在一個載體的任意位置引入外源DNA片段。此方法基於DNA片度的擴增
得到的大量的DNA可以作為線性載體擴增的模板。這個方法可實現將多個不同的外源基因同時插入某一個特定的載體的任意我們感興趣的位置 從而彌補了位點特異性重組系統中對特異位點和特殊系統的需求 為分子克隆和蛋白表達的調控提供廣闊的思路和方法。這種方法的原理是DNA片段之間的同源重組 現在應用比較廣泛的是由Clontech公司提供的In FusionTM system
它可以實現以下克隆需求 同時克隆多個DNA片段 Simultaneous cloning 基因的替換 Gene replacement 多位點突變 Multisite mutagenesis 多組分重組 Multi componentassembly 同時插入和刪除基因 Simultaneous insertionand deletion 引物設計及目的基因片段擴增該方法的原理和步驟同前in fusion PCR 只是這個方法中PCR產物需用Dpn 將模板消化。
載體線性化載體線性化的方法既可以用特異性酶切消化也可以通過常規PCR 使用PCR的方式使載體線性化消除了對特異性酶切位點的依賴和限制 同時徹底實現載體和片段之間的無縫連接 消除後續由於特殊鹼基序列的加入對實驗結果的影響 同時大華 35大節省了時間和成本投入。
fusion「連接」反應將純化的DNA片段和載體按照2 1的摩爾比混合入250 EP管中必要時可以加入In fusionTM enzyme 由Clontech提供 和相應buffer 是反應總體系為10 μl。之後共同轉入感受態細胞 進入篩選環節。 感受態細胞的制備在線蟲載體構建的整個過程中 最重要的實驗材料是各種促進反應進行的酶和高轉化效率的感受態細胞。不同的載體因其攜帶篩選基因或者特異表達的宿主的不同 需要諸如DH5α、TOP10等不同類型的感受態細胞 例如在Multisite gateway反應中 通常需要藉助ccdB的篩選機制 這種情況下就不能使用攜帶有ccdA基因的菌株 如TOP10F』 。
所以 在不同方法的構建中 要嚴格選擇感受態細胞類型。以下以實驗室常用的感受態細胞DH5α為例 詳述用氯化鈣 CaCl2 法的制備過程。 用CaCl2法制備感受態細胞的原理是通過低滲的CaCl2溶液在低溫 時處理快速生長的細菌從而得到感受態菌株細菌外形膨脹為球形 這樣的形態結構有利於外源DNA分子形成抗DNA酶的羥基 鈣磷酸復合物 這種復合物會粘附在細菌表面 如果熱激 細胞對DNA的吸收將大大加強。 實驗的關鍵是選取出於對數生長期的菌株 所有的操作必須盡可能保持在完全無污染無雜菌並且低溫的條件下進行。
實驗材料及准備事項 100ml 胰化蛋白腖 CaCl2的制備稱取22 CaCl2溶於200ml事先滅菌的水中 充分溶解後保存於4 冰箱中。
將濃度為100的甘油120 高溫滅菌。 器材10 ml移液管 需滅菌玻璃大培養皿 內鋪一張濾紙 需滅菌大、中、小槍頭各一盒 需滅菌 50 ml離心管 mlEP管 用鐵飯盒滅菌 100 ml SOB培養基需40個EP管 步驟如下 80冰箱里取出DH5α 常溫使其凍融後通過接種環接種細菌與無抗培養皿中。將培養板放入3 將預先水浴鍋滅菌的15ml離心管放在超凈台中 紫外照射半個小時以上。從培養皿上挑取單個菌落 接種至離心管中 導入3 ml無抗培養基LB 37 搖床振盪過夜培養 轉速為300 rpm 。次日取1 ml菌液接種至100 ml LB培養基中 以215 rpm的轉速37 培養2 3小時。期間 要每隔半個小時測定一下600 nm的OD值。 停止培養將燒瓶置於冰上10 15分鍾 同時將預先滅好菌的50 ml離心管也置於冰上冷卻至0 在超凈台中將菌液盡可能平均的分裝入兩個50 ml離心管中 以4000 rmp的轉速離心10分鍾。 棄上清將離心管倒置在濾紙上1分鍾 以吸干殘留的培養基。每個離心管中加入5 ml預冷的濃度為0 1M的CaCl2溶液 重懸菌體 並開始計時 可以用移液槍輕輕反復吹打30分鍾。 將懸浮好的菌液再次以4000rmp的轉速離心5分鍾 去掉上清 吸干殘余培養基後 每管加入2 ml預冷的濃度為0 M的CaCl2溶液反復吹打以重懸菌體 此時可以將兩個離心管合為一個 放於冰上預冷20分鍾 這期間 可以將已滅菌的1 mlEP管放於冰上預冷。 加入500 μl濃度為100 的甘油 mlEP管中。等全部分裝完成時 投於液氮中1個小時 之後再轉移到 80 冰箱中。 細菌轉化效率的檢測方法 設置陽性對照和陰性對照 陽性對照是為了估算細菌的轉化效率 陰性對照是排除感受態細胞被污染的可能 及查明失敗的可能因素。 陰性對照 只將感受態細胞塗於含某種抗性的平板上 而不加入任何DNA 正常情況下不應該有單菌落出現。 陽性對照 選擇標准質粒 一般是pUC19 以50 pg、100 pg的量分別轉化到感受態細胞里 將平板放於37 培養箱里過夜培養。數單菌落的個數以估計感受態的轉化效率。
效率估算公式為 轉化率 1000克隆 10pg DNA 當此值達到1 106時 可滿足一般克隆的實驗需求 當此值達到1 107時 可用作更復雜克隆的構建需求。 線蟲的顯微注射通過將外源基因顯微注射到雌雄同體的線蟲的性腺 gonad 能夠獲得有種系特異性的線蟲。DNA片段可以通過染色體之間的同源和非同源的整合被傳遞到下一代中。顯微注射的步驟如下 製作Pad將配置好的2 的瓊脂糖放在水浴鍋內防止其凝固。吸取100 μl於干凈的載玻片上 並迅速將另一塊載玻片輕壓上面 待瓊脂糖稍微乾燥時取走載玻片 標記Pad的正反面之後放於乾燥箱 80 中過夜。
拉制電極常常用含有內芯的硼硅玻璃微電極作為注射用電極 該電極的外徑為1 nm內徑0 75 nm。用拉制儀拉制好的電極尖端是封閉的 在用之前需要打開一個開口 開口的大小要適宜。
准備注射液注射液的體系一般選取10 目的載體質粒的濃度范圍為110 μl。其餘體積用1TE補平。以12 000 rpm轉速離心3分鍾。 吸取1μl注射液到拉好的電極中 放置1520分鍾 目的是為了使注射液通過內芯的虹吸作用流入電極尖端 並排除內氣泡。 拿出注射要用的Pad在上面滴一滴油 保證有足夠的油使線蟲減慢乾燥的過程 但不能太多以使其移動。 用一個干凈的針needle 觸碰到油上面 挑取N2時期的成蟲 線蟲挑取的區域應該遠離菌斑所在位置 以避免將菌落帶到pad上面。選擇有容易辨別的gonad的線蟲也同樣重要。將線蟲垂直放在pad上 使其gonad位於左側 通常 線蟲的陰部 vulva 會指向與needle的方向 兩側的gonad會直接與體壁對應。 當needle恰好位於載玻片上時將線蟲聚焦在10 的物鏡下 確定看到線蟲的gonad。將線蟲以和needle成15 到45 的角度擺放 通過輕輕降低needle使其和線蟲出於同一水平。轉換到40 物鏡 聚焦到胞體的gonad 使用調試器上下移動needle 直到針尖對准胞體的gonad。 輕輕沿著needle移動線蟲當needle插入線蟲體內時 按照gonad和蟲體壁處於相反位置的方式輕輕壓線蟲。輕旋調節器 knob 開始DNA注射液的流入 快速的開合 如果needle確定位於gonad處 此處部位會膨脹並充滿液體。如果液體流動不暢 輕輕觸碰桌面有助於解決此問題。要避免因加入液體過多導致液體沿著needle進入部位流散到線蟲的其他部位。 將needle從線蟲中拿出建議沿著逆時針方向。回到10 物鏡下 滴一滴M9 buffer使線蟲懸浮。使用眉毛挑將線蟲放置於另外一個含有M9 buffer的板子上。這樣做的目的是為了洗掉多餘的油。再將線蟲挑到含有細菌的板子上。一個板子上可以放置多條注射後的線蟲。
兩三天後 數F1轉基因線蟲 並將折射成功的線蟲單獨轉移到板子上以得到有穩定轉基因種系的線蟲。 顯微注射線蟲的gonadFig elegansgonad 3910 可能出現的問題及策略 注射後線蟲破裂或者死掉的原因可能是needle太大了 或者線蟲缺水死亡 方法可能是每注射一個線蟲的gonad就換一個新的needle 如果線蟲沒有直立 原因可能是pad太薄或者需要沒烘乾 可以通過將板子放在罩子上幾個小時來烘乾 如果線蟲乾的太快 可以使用更薄的pad或者在注射前將線蟲轉移到較濕的板子上。 實驗結果與討論實驗中用到的質粒的構建方法 在前言部分和方法部門已做了詳細闡述 需要研究的相關基因的啟動子的信息 諸如啟動子大小 表達部位等 藉助於相關文獻的報道 在Wormbase中截取特定長度的DNA序列 在NCBI中查找此基因的上下游序列和基因方向 藉助網頁UCSC提供的序列信息最終得到啟動子序列。但在設計啟動子引物時 必須留意到序列中3』端和5』端的序列可以根據引物的匹配性在小范圍內適當調整。還有一些神經元的位置因為缺乏確切表達譜的啟動子而無法最終確定。
線蟲有302個神經元 標記這些神經元需要大量的質粒構建。在實驗初期 我們通過傳統酶切連接方法和改造的常用線蟲載體組成的BP反應來實現。但隨著課題的發展和方法的改進 我們發現Multisite gateway方法更為便捷和高效 特別是在購買了雌雄同體線蟲啟動子庫後 這種技術不僅被用來標記線蟲神經元 更多的用在rescue實驗和鈣信號的測定的構建中。同時 為了使整個課題有一套完整的體系 我們又花費大量的精力將之前不太標準的由gateway反應得到的構建進行了改造 得到一個可以通用的表達體系。 改造Multisitegateway 中的載體pDESTR4 R3為pPD49 26 R4 R3 在使用Multisite gateway 技術構建多克隆載體的過程中 我們發現 這個系統並不是完美的
因為這個系統中各個重組位點的序列有一定的相似性 所以如果想要插入載體的片段的序列 特別是與引物匹配的那一段 與重組位點有相似性時 可能會導致這個技術中所涵蓋的反應失敗。同時 當我們想用一個啟動子驅動不止兩個以上基因的表達時 不能直接只用Invitrogen公司提供的試劑盒中的pDESTR4R3 因為外源基因在線蟲體內表達時 需要3』UTR穩定整個翻譯過程中的順利進行 但該公司試劑盒提供的載體中不含我們需要的3』UTR 因此 我們改造了一個新的LR反應的載體pPD49 26 R4R3 因為pPD49 26中含帶unc54 3』UTR 而且實驗證華 41明我們改造的載體同樣有很高的反應效率 1在Multisitegateway反應中驗證pPD49 26 R4 R3的有效性 Pgpa 4特異性標記ASI神經元 可以驅動TagRFP t在此神經元中表達。 為明場與熒光共定位的圖。Fig pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI can 改造attL1Promoter attL2為attL4 promoter attR1 驗證adaptor clone 如前所述 我們將攜帶attB1 attB2位點的啟動子進行改造得到了標准Multisite gateway反應中的第一個entry clone 在這個改造的過程中 需要引入一個中間反應物 adaptor clone。如果我們可以觀察到改造後的啟動子能夠驅動熒光蛋白在特定部位表達 由此可以驗證adaptor clone的有效性。在本課題中 我們使用改造後的啟動子Pdaf 7驅動熒光蛋白在神經元ASI里表達 由此adaptor clone的有效性得到驗證。
⑥ PCR體系配製時，50μl和20μl的體系各自具體物質和用量是多少啊
20ul 50ul
模板 1 1
dNTP 0.2 0.5
上游引物 0.15 0.45
下游引物 0.15 0.45
酶 0.2 0.5
10*buffer 2 5
ddH2O 16.3 42.1
buffer 為對應酶所需要，一般為10*
模板 有濃度的話200ng 無濃度就1ul
⑦ 如何稀釋實時熒光定量PCR的引物
100pmol/ul= 100umol/L= 100uM (Standard stock concentration of PCR Oligos)
V= 摩爾體積/摩爾濃度= 9.96nmol/100uM= 9.96nmol/ (100umol/L)=
9.96nmol/ (100000nmol/L)= 0.0000996L= 99.6ul
Hence, add 99.6ul Rnase-free ddH2O.
對任意PCR引物，正確加水體積應為V(ul)=N (nmol)*10,即濃度為100uM. ie,9.96*10= 99.6ul
註：一般情況下，所有PCR引物的stock concentration都是100uM. 使用時將其稀釋十倍為10uM進行PCR反應。
另：拿到PCR引物後，應先13.2k rpm離心一分鍾，加入65攝氏度預熱ddH2O配置成100umol溶液，再65攝氏度水浴1分鍾後儲藏。
再註：一樓為山寨加水法，千萬不要學習。我不知道中國的生物公司，像IDT這種公司作出的引物，由於序列差異，摩爾濃度相差還是很多的。我曾經訂過100bp+ 的引物，和20bp+的引物完全不是一回事...
⑧ 已知引物是9nmol,如何配製10umol/ul的引物工作液
稀釋引物要達到的濃度（pmol/ul）＝母液濃度（pmol/ul）×汲取母液的體積（ul）÷（汲取母液的體積（ul）＋加水量（ul））
引物一般來的時候是乾粉.這種狀態能保存最長的時間.
如果用的話要先離心,5分鍾（12000轉）.然後用它上面寫的nmol*1000/你的終濃度=你要加的水量
溶解液有TE和dd水.TE其實就是tris鹽酸和EDTA的混合液.理論上用TE保存好,不容易降解.
一般配的時候要先配成儲存液（濃度是100umol/L）,在配成使用液（濃度是10umol/L）.這樣的好處是引物不容易降解.
引物忌諱反復凍溶,大家要注意.如果你都配成了使用液就應該分裝.使用液放在4度（2/3個月沒問題的）,儲存液放在-20度.
引物稀釋很簡單,一般裝引物的管子上都標有引物的量如3.6nmol/OD,可直接往管中加360ul的無菌雙蒸水溶解就可以了,在加水之前要先高速離心管子幾分鍾,加水後要高速漩渦混勻幾分鍾就可以用了,此時的儲存濃度是10umol/L,如果體系是20ul一般加1ul引物(引物的使用濃度最大為10pmol/ul,但一般在0.5-5pmol/ul即可 ).
引物的濃度設定,不同的人有不同習慣,有的喜歡稀釋成100uM的,有的習慣於稀釋成20uM,也有的稀釋成10uM的.建議稀釋成20uM的濃度,因為如果你稀釋成100uM,當你所做PCR的體系不是很大的時候,體積太小了引物就不好加,容易產生誤差；如果是稀釋成10uM,引物濃度過低,容易降解.不過不管你稀釋成多大濃度的,最好分裝保存,免得反復凍融容易降解.
⑨ 100um體系的引物要稀釋成10um體系的引物,需要加rte多少ul
你這引物含量太高了
我的引物為20um,10ul體系的話加0.2ul足夠了
50ul體系加1ul肯定沒問題,要不了10ul
⑩ PCR技術擴增時引物與己提供DNA雙鏈有何關系5`端和3`端配對關系如何請舉例說明,並解釋相關名詞.謝謝
單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段的引導下，可以利用DNA聚合酶按5』→3』方向復制出互補DNA。這時單鏈DNA稱為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱為引物（Primer），合成的互補DNA稱為產物DNA。雙鏈DNA分子經高溫變性後成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應的引物引導下，用DNA聚合酶復制出產物DNA。PCR反應應用以上的基本過程，分別在待復制的已知序列DNA分子兩端各設計一條引物，其中在DNA 5』端的引物（Pl）對應於上鏈DNA單鏈的序列，3』端的引物（P2）對應於下鏈DNA單鏈的序列，Pl和P2按5』→3』方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四種脫氧核糖核苷酸等摩爾數混合物）的緩沖液中，通過高溫變性，使雙鏈DNA變成單鏈DNA模板，降低溫度復性，使引物與模板DNA配對，利用DNA聚合酶便可合成產物DNA。引物和dNTPs過量，則在同一反應體系中可重復高溫變性、低溫復性和DNA合成這一循環，使產物DNA重復合成，並且在重復過程中，前一循環的產物DNA可作為後一循環的模板DNA參與DNA的合成，使產物DNA的量按2n方式擴增，所以這一反應稱為聚合酶鏈式擴增反應。理論上如果引物及dNTP的量能夠滿足，則這一過程可無限重復，使模板DNA無限擴增。PCR反應使幾個DNA模板分子通過數小時擴增後增加到百萬倍以上，因此能用微量樣品獲取目的基因，同時也完成了基因在體外的克隆，成為分子生物學及基因工程中極為有用的研究手段。另外在醫學研究和醫療診斷中亦體現出極大的應用價值。
常規PCR反應用於已知DNA序列的擴增，反應循環數為25～35，變性溫度為94℃，復性溫度為37℃～55℃，合成延伸溫度為72℃，DNA聚合酶為Taq酶（可耐受95℃左右的高溫而不失活），DNA擴增倍數為106～109。
引物的設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能准確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設計要遵守以下幾條原則：①引物長度：15~25個核苷酸；②CG含量為40%~60%；③Tm值高於55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)計算]；④引物與模板非特異性配對位點的鹼基配對率小於70%；⑤兩條引物間配對鹼基數小於5個；⑥引物自身配對（特別是在引物的3』端）形成的莖環結構，莖的鹼基對數不大於3。由於影響引物的設計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設計。